一、構建方法

載體設計與構建

PVRIG過表達載體：選擇慢病毒或逆轉錄病毒載體（如pCDH、pLenti等），將PVRIG基因的全長CDS序列克隆至多克隆位點，并引入強啟動子（如CMV或EF1α）。

NFAT-Luc2報告系統：在Jurkat細胞中整合NFAT響應元件驅動的熒光素酶報告基因（如pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]），用于實時監測T細胞活化信號（如鈣離子通路）。

篩選標記：加入抗生素抗性基因（如嘌呤霉素、新霉素）或熒光標記（如GFP）用于穩轉株篩選。

病毒包裝與感染

將重組載體與包裝質粒（如psPAX2、pMD2.G）共轉染HEK293T細胞，收集含有慢病毒顆粒的上清。

通過離心感染或Polybrene增強感染效率，將病毒顆粒感染Jurkat-NFAT-Luc2細胞系。

穩轉株篩選與驗證

qPCR/Western Blot：檢測PVRIG mRNA及蛋白表達水平。

流式細胞術：若載體含熒光標簽（如GFP），可直接檢測陽性細胞比例。

抗生素篩選：使用嘌呤霉素（或相應抗生素）連續處理2-3周，篩選出穩定整合PVRIG的細胞株。

表達驗證：

功能驗證：通過抗CD3/CD28抗體刺激或鈣離子載體（如離子霉素）激活NFAT通路，檢測熒光素酶活性（Luciferase Assay）以確認報告系統的響應性。

二、科學意義

研究PVRIG的免疫功能

PVRIG是新興的免疫檢查點分子，與TIGIT/CD96/CD226家族共同調控T細胞和NK細胞功能。通過過表達模型可解析PVRIG對T細胞活化、增殖、細胞因子分泌（如IL-2、IFN-γ）的抑制或協同作用。

結合NFAT報告系統，可定量分析PVRIG對TCR信號通路（如PLCγ-Ca2?-NFAT軸）的影響。

腫瘤免疫治療靶點探索

PVRIG在多種腫瘤（如結直腸癌、卵巢癌）中高表達，可能通過介導免疫逃逸促進腫瘤進展。穩轉株可用于高通量篩選靶向PVRIG的抗體或小分子抑制劑，評估其對T細胞抗腫瘤活性的恢復效果。

與PD-1/CTLA-4抑制劑聯用時，可研究PVRIG阻斷劑的協同效應。

構建體外免疫微環境模型

將穩轉株與腫瘤細胞共培養，模擬腫瘤-T細胞相互作用，通過檢測熒光素酶信號動態評估PVRIG對T細胞浸潤和殺傷功能的影響。

結合CRISPR/Cas9敲除技術，可反向驗證PVRIG的上下游調控網絡。

三、技術難點與優化

轉染效率提升：Jurkat細胞轉染難度較高，需優化電穿孔參數（如電壓、脈沖時間）或改用慢病毒系統。

報告系統穩定性：長期傳代可能導致NFAT-Luc2信號衰減，需定期檢測熒光素酶活性并分選高表達亞群。

脫靶效應控制：需設置空載體對照（Vector Control）及未轉染野生型細胞，排除載體或抗生素對細胞功能的干擾。

四、應用前景

該穩轉株可廣泛應用于：

藥物開發：篩選靶向PVRIG的免疫治療藥物。

機制研究：解析PVRIG與DNAM-1/TIGIT等配體的相互作用機制。

臨床前模型：構建人源化小鼠模型，評估PVRIG抑制劑在體內的抗腫瘤效果。

通過這一模型的構建，研究者能夠深入探索PVRIG在免疫調控中的分子機制，并為開發基于PVRIG靶點的腫瘤免疫療法提供重要實驗工具和理論依據。