動物細胞原代培養的方法有哪些

動物細胞原代培養是直接從活體組織中分離細胞并進行shou次培養的技術，其核心是將組織塊分散為單細胞或小細胞團，再模擬體內環境促進細胞生長。根據組織分散方式的不同，常用方法主要有以下 4 類：

一、酶消化法（常用）

利用蛋白酶分解組織間的膠原蛋白、彈性蛋白等連接物質，使組織分散為單細胞，適用于多數實質性組織（如肝臟、腎臟、肌肉等）。

常用酶及特點：

胰蛋白酶（Trypsin）：常用，適用于消化纖維組織少的軟組織（如上皮組織），在 37℃下作用（濃度 0.25%-0.5%），pH 7.2-7.6 時活性最佳，消化后需用含血清的培養基終止反應（血清可抑制胰蛋白酶活性）。

膠原酶（Collagenase）：對膠原纖維分解能力強，適用于消化纖維組織豐富的組織（如結締組織、腫瘤組織），無需血清終止，可在含血清的培養基中直接使用。

EDTA（乙二胺四乙酸）：非酶類螯合劑，通過結合鈣離子破壞細胞間連接，常與胰蛋白酶混合使用（如 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA），增強消化效果。

操作步驟：

組織剪碎成 1-2mm3 的小塊，用 PBS 清洗 2-3 次去除血污；

加入適量酶溶液（覆蓋組織塊），37℃水浴振蕩消化（時間因組織而異，通常 30 分鐘至數小時）；

顯微鏡下觀察到多數細胞分散后，加入含血清的培養基終止消化；

過濾（用 200 目篩網）去除未消化的組織塊，離心（1000rpm，5 分鐘）收集細胞；

用培養基重懸細胞，計數后接種到培養瓶中。

二、組織塊培養法（簡單易行）

無需酶消化，直接將組織塊貼附于培養容器表面，利用組織塊邊緣細胞的遷移生長獲得細胞，適用于纖維組織豐富的組織（如皮膚、肌肉、胚胎組織）或對酶敏感的細胞。

操作步驟：

組織剪碎成 0.5-1mm3 的細小塊（越小越易貼壁），PBS 清洗后瀝干；

在培養瓶內壁均勻擺放組織塊（間距 0.5cm 左右），翻轉培養瓶，加入少量培養基（僅覆蓋瓶底即可）；

37℃培養箱靜置 2-4 小時，待組織塊貼附后，緩慢翻轉培養瓶（避免組織塊脫落），使培養基淹沒組織塊；

繼續培養，約 3-7 天后可見細胞從組織塊邊緣遷出，形成單層時進行傳代。

三、機械分散法（適用于易碎組織）

通過物理方法（如研磨、篩網過濾）分散組織，適用于結構疏松、易于分散的組織（如脾臟、淋巴結、骨髓等），優點是操作快速，對細胞損傷小。

操作步驟：

組織放入含少量培養基的平皿中，用注射器針頭或玻璃勻漿器輕輕研磨；

研磨后的細胞懸液通過篩網（100-200 目）過濾，去除雜質；

離心收集細胞，重懸后接種培養。

四、螯合劑處理法（輔助或單獨使用）

除 EDTA 外，檸檬酸鹽、草酸鹽等螯合劑也可通過破壞細胞間鈣離子依賴的連接實現組織分散，常與酶消化法聯合使用，或用于對酶敏感的細胞（如上皮細胞）。

不同方法的選擇原則

酶消化法：優先用于需要獲得大量單細胞、且組織較致密的樣本（如肝臟、腎臟）；

組織塊培養法：適合纖維豐富、酶消化效果差的組織（如皮膚、肌肉），或希望保留更多細胞間相互作用的場景；

機械分散法：僅用于結構疏松的組織，避免對脆弱細胞造成機械損傷。

無論哪種方法，原代培養的核心是無菌操作和溫和處理（減少對細胞的損傷），且shou次培養時細胞密度不宜過低（通常 10?-10? cells/mL），以提高存活率。